實驗室常用的核酸檢測方法有A260/A280吸收光檢測法和熒光檢測法。其中吸收光檢測法主要用于核酸純度檢測和濃度檢測，但是受限于吸收光方法學的局限性，濃度檢測準確度和靈敏度相比熒光方法要低。

熒光檢測法使用的熒光染料能夠特異地與核酸分子相結合，在特定波長光源的激發下發出熒光，核酸濃度在一定范圍內與熒光強度成正比，可有效區分出雙鏈 DNA 、單鏈 DNA 和 RNA ，同時不受游離核苷酸、蛋白、鹽離子和其他雜質的干擾。此外，與核酸結合的染料相較其游離態熒光信號增強數十倍至數百倍，使檢測結果可以獲得更高的信噪比。

因此，對于一些需要**測定低濃度樣本的實驗，熒光染料法是不可或缺的，例如基因芯片、測序文庫構建等。在新一代測序實驗中，核酸樣品的準確定量對核酸的片段化效果有直接的影響，例如在使用酶切方法時，過高的核酸濃度使得酶切不完全，導致文庫中大片段偏多；而過低的核酸濃度容易導致酶切過度，造成小片段增多。

傳統的熒光染料法使用微量離心管檢測，通量低且檢測時間長，滿足難以滿足大基數樣本的快速定量。采用 96 孔微孔板結合酶標儀進行熒光染料法核酸定量，既能滿足低濃度樣本**定量的需求，又實現了高通量檢測的目的。安捷倫BioTek Synergy 系列多功能酶標儀產品，已在該方向上為許多實驗者解決了燃眉之急。

下面筆者將以 Qubit?dsDNA BR Assay Kit 在 Synergy Neo2 上的應用為例，為大家介紹使用 Synergy 系列多功能微孔板檢測儀制作標準曲線并測定 DNA 濃度的方法。

材料：

·Qubit?dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen，# Q32850)

·純化的鯡魚精子 DNA (Sigma-Aldrich, # D6898)，于 TE 緩沖液中保存

·TE 緩沖液 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0).

·96 孔黑色平底聚苯乙烯微孔板(Corning, #3915)

·量程為 10 -200μL 的移液器

·GFP 濾光片 Cube（PN 1035108 EX 485/20 EM 530/25，DM 510）

·

方法：

·用緩沖液將 200× 濃縮液稀釋 200 倍。

·為適配試劑本身的分析范圍，將 TE 緩沖液中的 2.2 mg/mL 鯡魚精子 DNA 溶液梯度稀釋成 4 個梯度：0.1 、1 、10 和1000 ng/μL 。

·用移液器將樣品和 10 μL DNA 標準品添加到 96 孔板中，然后添加適量的工作液使*終體積為 200μL ，室溫孵育 5 分鐘后上機檢測。

程序設定：

1. 在孔板類型下拉菜單中選擇“96-well plate”

2. 在檢測方法界面依次選擇“熒光強度”-“終點/動力學”-“濾光片”

3. 在檢測步驟界面設置好標簽，選擇單 PMT 頂部檢測，下拉選擇“485/528”濾光片組，增益設置為 50

板布局：

設置標準品、本底和樣品位置，并根據配置的標準品濃度進行標注

數據處理：

1. 本底扣除

2. 標準品曲線設置：將 X 軸設置為濃度，Y 軸為扣除本底的 528nm 處熒光值，曲線擬合選擇四參數非線性回歸，并將軸演示都設置為對數

結果：

在 Gen5? 中繪制四參數非線性擬合的標準曲線，顯示相關性良好

上述實驗表明，Synergy Neo2 可以提供有效的高通量核酸熒光定量方法。

除此之外，Synergy 系列多功能微孔板檢測儀提供三種震板模式和恒溫孵育功能，實驗者可預先設置程序，在完成加樣后直接將 96 孔板放入檢測儀中進行混勻和避光孵育，無需繁復操作，直接檢測。Synergy Neo2 在檢測速度和靈敏度上具有無可比擬的巨大優勢：可以在 6 秒內完成 96 孔板的熒光強度檢測；當使用 384 孔板檢測時，頂部檢測模塊熒光檢測靈敏度高達 0.2 pM 。

熒光染料法可以測定單種核酸的濃度卻無法鑒定樣品純度，但在實際操作中，樣品的純度也是保證實驗結果可靠的重要因素。核酸純度通常由紫外分光光度法得到，主要以核酸在 260nm 和 280nm 處吸光度的比值衡量。

Synergy 系列多功能微孔板檢測儀不僅支持熒光強度的檢測，還提供全波長吸收光檢測和發光檢測。搭配 Take3 或 Take3 Trio 微量核酸濃度檢測板和 Gen5? 預設程序，可在一次運行中測定 16 或 48 個樣品，實現高通量紫外吸收光核酸定量，大大提高檢測效率。擁有一臺儀器即可完成高質量微量核酸濃度和純度測定，為核酸濃度測定提供真正的高通量解決方案。

高通量解決方案

Agilent BioTek Synergy 系列多功能微孔板檢測儀，可實現全波長吸收光、熒光和化學發光檢測。獨特的 Hybrid 技術可為多種應用提供出色的靈敏度和靈活性：四光柵系統支持全波長熒光檢測，波長靈活選擇，帶寬連續可調（Synergy H1 為 9 ~ 50 nm，Synergy Neo2 為 3 ~ 50 nm ），能夠更好地兼顧熒光探針的特異性和靈敏度；濾光片系統搭載靈敏的高透射濾光片，支持均相時間分辨熒光（HTRF）、熒光偏振（FP）等**熒光檢測。二者光路獨立，可確保在所有檢測模式下具有出色的性能。

BioTek Synergy Neo2 應用范圍極廣，適用于各類藥物篩選、分子相互作用、細胞代謝、細胞因子檢測等方向，涵蓋細胞、分子、藥物等多個領域的實驗需求。此外，Synergy Neo2 可裝配用于 ALPHA 和 TRF 檢測的激光器，有效提高靈敏度和讀取速度。4 個 PMT 提供超快測量速度，頂部雙 PMT 模塊可同時進行兩次測量，能同時采集兩個發射信號，有效地將測量速度提高一倍，可以一次性獲得 FP 、FRET 和 TR-FRET 測量結果，節省實驗時間。同時，四區溫控技術提供穩定溫度控制，外接氣控模塊控制艙內 O2與 CO2濃度，為活細胞的長期檢測提供了適宜的環境條件。